Dispersión y genes relacionados con la resistencia a insecticidas en Triatoma infestans: su vinculación con el control del vector de la enfermedad de Chagas

Entre las especies transmisoras de la enfermedad de Chagas de mayor importancia a nivel sanitario se destaca Triatoma infestans, considerada el principal vector en América del Sur (entre las latitudes 10° y 46° S). Los programas de control de la transmisión de la enfermedad promueven la eliminación de las poblaciones del vector T. infestans mediante la fumigación con insecticidas en las regiones endémicas. Sin embargo, esta estrategia, presenta dificultades debido en parte a la extensión y variabilidad de las áreas endémicas y por otro lado, al tiempo requerido para prevenir la recuperación de las poblaciones tratadas con insecticidas. La efectividad a largo plazo de las campañas de control es en gran medida dependiente del conocimiento de la estructura de las poblaciones del vector. El análisis de la estructura genética con un enfoque filogeográfico de poblaciones del vector en regiones endémicas de Argentina, mediante secuencias de genes mitocondriales y nucleares descriptas por primera vez para ese fin, permitirá aportar nuevas bases para la comprensión de la dinámica y evolución de las poblaciones del insecto vector y resolver interrogantes sobre procesos como por ejemplo los de dispersión y recolonización de la especie transmisora que afectan en forma directa a la eficiencia de los intentos de control. Los patrones de dispersión de esta especie estarían estrechamente vinculados con la transmisión de la enfermedad de Chagas. Por lo tanto, esta información podría ser de utilidad para la optimización del diseño de las intervenciones de control a implementar en el área endémica que conducirían a una disminución del impacto que esta enfermedad provoca en la población. Por otra parte, se han observado fallas en el control del vector debido a la existencia de resistencia a los insecticidas piretroides. Entre los mecanismos que confieren resistencia a insecticidas se han descripto los que implican cambios en canales de sodio, conocido como resistencia “knockdown” (Kdr), y aquellos que provocan un aumento de la actividad de enzimas responsables de su metabolismo. Con respecto al último mecanismo, las evidencias sugieren que las enzimas mono-oxigenasas citocromo P450 tienen comunmente un rol primario en la resistencia a insecticidas piretroides. Incrementos en la expresión a nivel de la transcripción de genes de citocromos P450 (CYP450) son frecuentemente considerados responsables de aumentar el metabolismo de insecticidas y parece ser un fenómeno común en la evolución del desarrollo de resistencia en insectos. El estudio de la posible relación de genes CYP450, que proponemos caracterizar en T. infestans, con la resistencia a insecticidas podría aportar nuevas bases para el desarrollo del manejo de esa resistencia. Sin embargo, mientras que existen múltiples genes CYP450 en el genoma de insectos, sólo un gen NADPH citocromo P450 reductasa (CPR) existe en el genoma de cada insecto. Por este motivo, se propone también caracterizar en el vector este gen que codifica para una enzima que actúa en la transferencia de electrones desde la forma reducida de NADPH a los citocromos P450, así como investigar el efecto de su silenciamiento en poblaciones de T. infestans resistentes a insecticidas piretroides. Además, con el propósito de analizar si la existencia de resistencia a insecticidas piretroides puede ser el resultado de la acción de los citocromo P450 y/o de otros factores, se investigará en las poblaciones resistentes la posible existencia de una mutación de un gen de canal de sodio relacionada con resistencia a insecticidas (Kdr) que ha sido descripta para T. infestans. Este estudio proveería información de utilidad para el desarrollo de estrategias alternativas de control que serían de suma importancia en regiones en las que las poblaciones de este vector presentan resistencia a los insecticidas y, por lo tanto, tendría claramente implicancias importantes para el manejo de la resistencia en este vector.

Aspectos bioquímicos y celulares de la reproducción de los vectores de la enfermedad de Chagas: regulación e importancia fisiológica.

En la hipótesis de trabajo del presente proyecto se considera la importancia del metabolismo de lípidos y proteínas en los insectos hematófagos, en particular en los vectores de la enfermedad de Chagas, para afrontar exitosamente la demanda energética de la reproducción. Las hembras de estas especies pueden ingerir una comida de sangre abundante en lípidos y proteínas, los que son modificados en el intestino para su utilización y posterior almacenamiento en estructuras organizadas en el tejido ovárico, sustentando así el rápido crecimiento de los ovocitos. Estos aspectos resultan críticos para el ciclo de vida del insecto y para el mantenimiento de la cadena epidemiológica de la enfermedad. En estas especies, recientemente hemos caracterizado a nivel bioquímico y celular la interacción entre lipoproteínas y tejidos [Fruttero y col., Insect Biochem. Mol. Biol. 39: 322-331 (2009); Fruttero y col. Biocel 33 (3): 260 (2009)] y las fases del ciclo reproductivo [Aguirre y col., J. Insect Physiol. 54: 393-402 (2008)]. No obstante, los factores que participan en su regulación son aún escasamente conocidos. En este contexto, el estudio propone emplear dos especies de triatominos con el objeto de: (1) caracterizar los factores involucrados en la formación y regulación de reservas nutricionales en los ovocitos; (2) analizar los eventos que participan en la regresión del tejido ovárico: atresia folicular y mecanismos de muerte celular. (3) evaluar el impacto de productos naturales (ureasas vegetales y péptidos derivados) en el desarrollo del tejido ovárico. Para la ejecución de los objetivos se llevarán a cabo ensayos in vivo e in vitro con trazadores fluorescentes, fraccionamiento subcelular, estudios de expresión de proteínas (mRNA y proteína), estudios histo-morfológicos, ultraestructurales e inmunocitoquímicos, microscopía láser confocalizada, ensayos de actividad enzimática, ELISA, western-blot, electroforesis bidimensional, espectrometria de masas en tándem, etc. También se evaluarán los mecanismos de muerte celular (apoptosis/autofagia) mediante microscopía electrónica, detección de apoptosis in situ (TUNEL), inmunofluorescencia, etc. Los resultados obtenidos permitirán un mejor conocimiento sobre la fisiología y bioquímica de estos vectores, los que resultan indispensables en el diseño de nuevas estrategias para su control. Debido a la carencia de un tratamiento específico para la enfermedad y a la falta de métodos preventivos (vacuna), el control del vector es una de las vías más importantes para reducir la incidencia de la enfermedad. Actualmente, la situación socio-económica que sufren amplios núcleos de nuestra población propicia condiciones de vida que facilitan la reproducción de los vectores y la transmisión vectorial del parásito. El estudio permitirá además explorar aspectos bioquímicos y celulares básicos, generando conocimientos que podrían ser extensivos a otros insectos de importancia económica en la ganadería y/o agricultura.

Guía para la implementación de BPM en la producción de carne de cerdo y derivados tendientes a eliminar el riesgo de presencia de Trichinella Spiralis.

En el marco de nuestra investigación: “Evaluación cuantitativa de riesgo para la salud pública por trichinelosis debido al consumo de productos elaborados con carne porcina en la provincia de Santa Fe y Córdoba”, financiada por la Universidad Católica de Córdoba, que se encuentra en su último año de ejecución; hemos observando que los establecimientos productores no cuentan con un correcto sistema de Buenas prácticas de manufacturas, diseñado e implementado para prevenir la presencia del parásito Trichinella spiralis. Por ello, surgió la inquietud de realizar un guía con los contenidos apropiados obligatorios por la Legislación Vigente (Ley 18.284, Código Alimentario Argentino, y el Decreto 4238/68, Ley Federal de Carnes), sumado a la experiencia propia de los integrantes en cuanto a la temática y a la idea de transmitir dicha experiencia en forma de contenidos sencillos, didácticos y gráficos, de fácil aplicación, prácticos y accesibles a todos los sectores de la cadena de producción y comercialización (tanto a grandes como a pequeños productores, incluidos los productores familiares) y a la comunidad en general. La enfermedad es endémica en la provincia de Córdoba y el último año se han presentado numerosos casos que alertan sobre su presentación, ya que la misma tiene impacto en salud pública y en la economía de la provincia ya que se trata de un producto con fuerte desarrollo en regiones bien definidas y sensible al turismo.

“Estudio de los mecanismos moleculares involucrados en la inmunosupresión observada durante la infección con Trypanosoma cruzi: Rol de la vía PD-1/PD1-L y E3 ubiquitina ligasas”.

Trypanosoma cruzi es el agente causal de la enfermedad de Chagas, un problema de salud importante en América Latina, así como también en América Central, ya que causa infección crónica afectando a millones de personas [1]. Durante esta enfermedad se han descripto varias alteraciones de la respuesta inmune, entre ellas una severa inmunosupresión durante la etapa aguda de la infección, tanto en humanos como en ratones. Células T provenientes de ratones infectados activadas in vitro, muestran reducción en la respuesta proliferativa a mitógenos, característica de un estado de inmunosupresión [2-4]. La falla del sistema inmune durante estadios tempranos de la infección probablemente colabore con la diseminación y el establecimiento del parásito. Un gran número de estudios se han focalizado en la identificación de mecanismos moleculares responsables del fenómeno de inmunosupresión, entre los mecanismos citados se ha demostrado presencia de células supresoras [5-9], factores inmunosupresores presentes en el parásito [2, 3, 10-13], producción excesiva de óxido nítrico [14], disminuida producción de IL-2 y reducida expresión del receptor de IL2 en células de bazo de animales infectados [9, 15-17]. Muchos de estos mecanismos han sido exhaustivamente investigados, sin embargo no está del todo claro si existen mecanismos adicionales involucrados en la inmunosupresión de la célula T. Adicionalmente, en los últimos años nuevas moléculas que median la regulación negativa de la célula T, entre las cuales están PD-1/PD1-L [18], arginasa [19] y E3 ubiquitina ligasas [20-22], han sido reportadas durante inmunosupresión en diversas infecciones.

Participación de las células supresoras mieloides (CSM) y T regulatorias (Treg) en el control de la infección con Trypanosoma cruzi y el desarrollo de la patología inflamatoria asociada a la infeccion

La infección de mamíferos con el T. cruzi resulta en diferentes alteraciones inmunológicas que permiten la persistencia crónica del parásito y destrucción inflamatoria progresiva del tejido cardiaco, nervioso y hepático. Los mecanismos responsables de la patología de la enfermedad de Chagas han sido materia de intensa investigación habiéndose propuesto que el daño producido en esta enfermedad puede ser consecuencia de la respuesta inflamatoria del individuo infectado y/o de una acción directa del parásito sobre los tejidos del hospedador. El propósito del presente proyecto es estudiar comparativamente, en dos cepas de ratones con diferente susceptibilidad a la infección y desarrollo de patología, la participación y los mecanismos efectores de las células supresoras mieloides (CSM) y las celulas T regulatorias inducidas por la infección experimental con Trypanosoma cruzi en el control de la infección con este protozoario y en el desarrollo de la patología hepática siendo los objetivos especificos desarrolar: - Investigar la generación y/o reclutamiento de células de CSM en bazo e hígado de ratones infectados con Trypanosoma cruzi y su contribución a la desigual susceptibilidad a la infección y respuesta inmune desarrollada en las cepas de ratones BALB/c y C57BL/6; - Investigar la capacidad de las CSM inducidas por la infección con T. cruzi en bazo e hígado de ratones de ambas cepas para suprimir la respuesta de células T in vitro e indagar sobre los mecanismos de supresión utilizados; - Investigar la generación y/o reclutamiento de células Treg durante la infección experimental con Trypanosoma cruzi, su participación en la desigual susceptibilidad a la infección y respuesta inmune desarrollada en ambas cepas de ratones y los mecanismos de supresión utilizados. - Analizar en tejido hepático o leucocitos infiltrantes la presencia de COX2, PGE2, MMP2 y 9, IL1b, IL6, IDO, IL10 y GM-CSF capaces de inducir la expansión de las CSM; - Dilucidar si la administración del ligando para TLR2 (Pam3CyS) previo a la infección de ratones C57BL/6 (en los cuales se detecta un menor número de CSM) es capaz de modular la respuesta inflamatoria y el daño hepático a través de la inducción de CSM y/o T reg en hígado y bazo. La comprension de los eventos celulares y moleculares que regulan la producción de citoquinas pro- y anti-inflamatorias y otros mediadores, así como el papel de los receptores de la inmunidad innata durante la infección con T. cruzi contribuirá a responder interrogantes que son claves para el diseño de nuevas estrategias de intervención inmune tendientes a preservar los mecanismos de defensa del huésped.

Identificación de aspectos inmunológicos en la infección placentaria por Trypanosoma cruzi en modelos in vitro e in vivo.

El Trypanosoma cruzi, agente causal del Chagas, atraviesa la placenta, pudiendo infectar el feto y causando la enfermedad de Chagas congénita. Hay evidencias de que la competencia inmunológica de la placenta juega un rol en la transmisión congénita. El proceso de infección placentario puede verse modificado por el juego entre factores deletéreos para T. cruzi, como el óxido nítrico (NO), estrés nitrosativo-oxidativo (EO) y la cantidad de parásitos y capacidad de la célula parasitaria de resistir, invadir y proliferar dentro del tejido placentario. El factor inhibitorio de la migración de macrófagos (MIF) es una citoquina proinflamatoria que juega un importante rol inmuno-regulatorio que estimula la producción de NO. Por ello postulamos como hipótesis que T. cruzi incrementa la producción de MIF en placenta, con aumento de citoquinas proinflamatorias, óxido nítrico e incremento del estrés nitrosativo, participando en la infección de la placenta y el mecanismo de transmisión congénita de la enfermedad. Los objetivos específicos son: a)Analizar el sistema MIF - ICAM1 - NO en la infección de explantos de vellosidades placentarias por formas trypomastigotes del T. cruzi en diseños experimentales in vitro. b)Verificar estado de estrés oxidativo-nitrosativo y alteraciones de la barrera placentaria inducido por óxido nítrico en explantos placentarios en presencia de T. cruzi in vitro. c)Analizar la expresión de MIF e ICAM-1 en placentas en un modelo de Chagas congénito en ratones infectados con T. cruzi de la cepa Tulahuen con dieta normoproteica y normocalorica. d)Verificar nivel de transmisión congénita en las crías de ratones infectados por T. cruzi según expresión de MIF e ICAM1 con dietas normales para estos animales. Los diseños experimentales serán in Vitro mediante empleo de explantos de placentas en cultivo en interacción con formas infectivas de T. cruzi y diseños en ratones en un modelo de transmisión congénita. Las técnicas a emplear serán cultivos de tejidos, técnicas inmunohistoquímicas, western blot, PCR y qPCR, RT-qPCR, mediciones analíticas en medios de cultivos y plasma y suero de ratones. Esperamos encontrar una respuesta inflamatoria exacerbada, como ya ha sido descripta en embarazadas que produjeron transmisión congénita de la enfermedad de Chagas a sus hijos, el incremento de citoquinas pro-inflamatorias y del estrés nitrosativo como el observado in vitro inducido por T. cruzi, (resultados preliminares) que podrían dañar la barrera placentaria y favorecer la transmisión congénita de la enfermedad de Chagas mediada por MIF. Como MIF se puede detectar en circulación sanguínea de la embarazada que en parte es aportado por la placenta (Cardalopolis y col., 2012), podría emplearse como un indicador de la probabilidad de transmisión congénita de la enfermedad.

Patrones de dispersión de una nueva enfermedad viral en el cultivo de maíz, en Argentina

El maíz es uno de los principales cereales, ubicándose tercero en el ranking de producción mundial. Las enfermedades virales en el cultivo de maíz son factores importantes de pérdidas en la producción, en el mundo. Se ha citado mundialmente la presencia de varios rhabdovirus en maíz, aunque ninguno en Argentina. Maize mosaic virus (MMV) es el más importante debido a las pérdidas que ocasiona. Durante 2006/07 se detectó en trigo Argentina, un Cytorhabdovirus denominado Cereal Rhabdovirus caracterizado serológicamente como Barley yellow striate mosaic virus (BYSMV). Desde 2000/01 hasta la actualidad, se observan plantas de maíz con achaparramiento, esterilidad y estriado amarillo en hojas, en localidades de Córdoba y Santa Fe. Se observaron al microscopio electrónico partículas de rhabdovirus en el citoplasma de las células. Pruebas serológicas para MMV resultaron negativas. Esta virosis fue transmitida a plantas de maíz sanas por el delfácido Peregrinus maidis. Se amplificó un segmento del gen de la polimerasa L de rhabdovirus, mediante RT-PCR con iniciadores degenerados y se obtuvieron las relaciones filogenéticas con otros rhabdovirus, confirmando que se trata de un miembro del género Cytorhabdovirus. Se trataría de un virus nuevo, de la familia Rhabdoviridae presente en diversas localidades del área maicera argentina. El objetivo de este proyecto es estudiar la epidemiología de este virus, mediante la reconstrucción de su historia demográfica y patrones espacio-temporales, utilizando análisis de coalescencia y filogeografía. Se busca: Determinar la secuencia genómica completa del virus en estudio; Obtener iniciadores específicos para el gen de la nucleocápside; Obtener las secuencias nucleotídicas del gen de la nucleocápside viral de aislamientos de diferentes localidades del área maicera argentina; Analizar los patrones filogeográficos de dichos aislamientos. Materiales y métodos. Recolección de material enfermo. Se colectarán plantas de maíz con sintomatología de estriado amarillo, en distintas localidades de Córdoba y Santa Fe. Secuenciación del genoma completo viral. Se purificará el virus en estudio a partir de tejido enfermo (Creamer, 1992). Se extraerá ARN total y se lo enviará al servicio de pirosecuenciación (INDEAR, Argentina). Las secuencias obtenidas serán analizadas utilizando software específico (Lasergene 10, DNASTAR, entre otros). Diseño de iniciadores específicos para el gen de la proteína N viral. Serán diseñados a partir de la secuencia del genoma completo del virus. Determinación de patrones filogeográficos. Se extraerá ARN total de plantas sintomáticas de distintas localidades argentinas. Se amplificará el gen N de cada uno de los aislamientos, se clonarán y secuenciarán estos fragmentos y se alinearán las secuencias obtenidas. Se reconstruirá la filogenia mediante metodología Bayesiana y se realizará un análisis de coalescencia. Finalmente se analizará el patrón filogeográfico del rhabdovirus en estudio. Con el presente trabajo se espera avanzar en el conocimiento de este nuevo virus que afecta cultivos de maíz en Argentina. Se pretende obtener la secuencia genómica completa viral, lo que significará un avance en la caracterización e identificación del mismo. Se busca conocer sus patrones de dispersión espacio-temporales, para comprender los orígenes y posible evolución hacia otras regiones del país. El análisis de secuencias genómicas, brinda una herramienta rápida y de menor esfuerzo de muestreo en el estudio epidemiológico de las poblaciones. El conocimiento de la distribución actual e histórica de este nuevo virus sería crucial para futuros planes de manejo de la enfermedad. El tema de investigación se lleva a cabo en el marco de una tesis doctoral con el apoyo de una beca de formación de CONICET. La transferencia es constante a traves del contacto con productores y asesores agrícolas y mediante la realización de jornadas, charlas, cursos y publicaciones periódicas en medios de difusión.